摘　要:目的　探索一種簡單、方便、有效的彎曲菌菌種保存方法。方法　采用含30 %甘油的腦心浸液肉湯,將實驗室保存的19 株彎曲菌于- 30 ℃和- 70 ℃分別保存,每個菌株3 個菌種管。1 年后,采用5 %脫纖維羊血的布氏肉湯進(jìn)行增菌,然后轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平板,比較存活效果。結(jié)果　- 30 ℃條件下采用多管法保存彎曲菌可以獲得與- 70 ℃條件下保存相當(dāng)?shù)男Ч�。結(jié)論　采用多管法(每株菌3個菌種管) 于- 30 ℃冷凍保存彎曲菌是一個簡單、方便、有效、實用的方法。

　　關(guān)鍵詞:彎曲桿菌屬保存,生物學(xué)低溫保存

　　彎曲菌是一類對生長條件要求非常苛刻的細(xì)菌,需要在微需氧的環(huán)境下(約10 % CO2 , 5 % O2 ) 才能良好地生長。彎曲菌也是一類保存比較困難的細(xì)菌,用一般的方法保存有一定的困難,在實際菌種保藏工作中如操作不當(dāng)極易造成菌種的死亡。有效的保存分離菌株是對彎曲菌進(jìn)行研究的基礎(chǔ)。在過去的研究中,采用的保存方法種類比較多,文獻(xiàn)[1 ,2]采用真空冷凍干燥技術(shù)進(jìn)行保存菌種,在FDA 的方法[3] 中,介紹冷凍培養(yǎng)基- 70 ℃冷凍保存以及半固體保存方法,在國標(biāo)[4] 中短期采用4 ℃冰箱微需氧保存,長期保存用凍干法。在上述方法中最穩(wěn)定有效的方法是真空冷凍干燥技術(shù),但是該方法較為復(fù)雜,還需要冷凍干燥設(shè)備。而半固體和新鮮菌落于微需氧條件下保存的時間比較短。- 70 ℃冷凍保存方法相對簡單,但是- 70 ℃冰箱價格昂貴,基層單位比較少。在對菌種的復(fù)蘇方法中,有的直接將菌種涂布平板微需氧培養(yǎng)[1 ] ,有的將菌種加入增菌液中進(jìn)行增菌后再涂布血平板[3 ] ,復(fù)蘇方法的差異會嚴(yán)重影響菌種保存的效果。為探索一套方便有效的彎曲菌菌種保存及復(fù)蘇方法,本實驗室用30 %的甘油腦心浸液肉湯,分別在- 30 ℃及- 70 ℃對彎曲菌菌種進(jìn)行多管(每個菌種3 個管) 冷凍保藏,復(fù)蘇時用不加抗生素的布氏肉湯,于微需氧條件復(fù)蘇培養(yǎng)24 h ,轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平板微需氧條件培養(yǎng)48 h。實驗的菌株為2004 年及2005 年分離到的彎曲菌共19 株,其中包括空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌和紅嘴鷗彎曲菌。

　　1 　材料及方法

　　111 　培養(yǎng)基　哥倫比亞血瓊脂　哥倫比亞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(OXOID) ,按照培養(yǎng)基配置的說明進(jìn)行配置并進(jìn)行高壓滅菌,將培養(yǎng)基保溫到45 ℃,然后加入5 %的脫纖維羊血制血平板。腦心浸液肉湯　腦心浸液干粉培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司) 按照培養(yǎng)基的配置說明操作,高壓滅菌。布氏肉湯2 號營養(yǎng)肉湯(OXOID ,Basing Stoke ,Hampshire ,England) 按照培養(yǎng)基說明進(jìn)行配制,高壓滅菌,加入5 %脫纖維羊血。

　　112 　菌株　2004 年及2005 年北京市疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品衛(wèi)生所微生物實驗室從市場銷售的禽肉中分離到的彎曲菌屬菌株19 株,其中包括空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌和紅嘴鷗彎曲菌。

　　113 　低溫冰箱　- 30 ℃低溫冰箱(SANYO ,MedicalFreezer) 、- 70 ℃冰箱(SANYO ultra2low freezer) ,塑料菌種管(118 ml 冷凍管、彩蓋硅膠墊圈) (上海嘉迪塑料制品有限公司) 。

　　114 　方法

　　11411 　菌種制備　將彎曲菌菌種劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板, 42 ℃微需氧條件下培養(yǎng)48 h ,獲得活力旺盛的菌體。菌種保存　按照體積比將腦心浸液肉湯加入

　　30 %的滅菌甘油,分裝到塑料菌種保存管中備用,也可以將其冷凍保存隨用隨取。用接種環(huán)刮取哥倫比亞平皿表面的菌體,溶于腦心浸液肉湯甘油中。將菌濃度調(diào)到6 個麥?zhǔn)蠞舛纫陨稀�將制好的腦心浸液甘油菌懸液,于- 30 ℃或- 70 ℃的冰箱中迅速冷凍。

　　11412 　菌種的復(fù)蘇　將菌種管從冰箱中取出,室溫放置呈為液態(tài)后,將整管的菌懸液加入到未加抗生素的布氏肉湯10 ml 中,在微需氧的條件下培養(yǎng)24h ,如菌體損傷嚴(yán)重,需要復(fù)蘇的時間較長,培養(yǎng)24 h菌體得不到有效的復(fù)蘇,需要再繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)24～48 h 的增菌液劃線接種于哥倫比亞血平板,于微需氧的條件下培養(yǎng)48 h 得到復(fù)蘇的菌種。將本實驗室從禽類中分離到的彎曲菌19 株按上述

　　方法于2005 年4 月保存,并于2006 年4 月取出,用上述方法進(jìn)行復(fù)蘇,檢驗菌種保存的效果。

　　2 　結(jié)果

　　211 　在- 70 ℃保存的菌種共19 株,采用本方法全

　　部存活。

　　212 　在- 30 ℃保存的菌種共19 株,在菌種復(fù)蘇培養(yǎng)過程中3 個菌種管中的彎曲菌在增菌過程中沒有復(fù)蘇成功,但由于在保存的過程中,1 個菌株保存了

　　3 管,其它菌種管保存的菌株用相同方法進(jìn)行培養(yǎng)獲得了成功。本文采用加入30 %甘油的腦心浸出液肉湯對彎曲菌進(jìn)行菌種保存,用未加抗生素的布氏肉湯進(jìn)行復(fù)蘇,此方法簡單、實用、有效,不需要特殊的設(shè)備,適用于基層微生物實驗室日常彎曲菌菌株保存工作。